El primer recorrido partió desde el microcentro de Asunción, específicamente sobre la avenida Cristóbal Colón, entre Palma y Estrella, en dirección a Ñemby. Durante su trayecto atravesó calles tradicionales como Oliva, Cerro Corá, EE.UU. y Luis A. Herrera, para luego tomar vías de mayor tránsito como Silvio Pettirossi, Perú, Teniente Garay y José Félix Bogado. Más adelante, el bus se incorporó a arterias estratégicas como la avenida Argaña, Cacique Lambaré, Augusto Roa Bastos, República Argentina y Fernando de la Mora, hasta empalmar con la Ruta PY01 (ex Acceso Sur). El recorrido finalizó en pleno centro de Ñemby, sobre la calle 9 de Agosto, tras ingresar por Santa Rosa y Teniente 1º Galeano.
En el trayecto de regreso, la línea inició en Ñemby, retomó la PY01 y volvió a cruzar la Av. Fernando de la Mora, conectando con calles urbanas como Tarumá, Cacique Tavapy, Haití, Perú, Teniente Fariña, Brasil, Azara, General Díaz y Hernandarias, hasta regresar al punto de partida en la avenida Cristóbal Colón.
El servicio adjudicado a la empresa Automotores Guaraní S.R.L. funcionará hasta las 03:20, ofreciendo una alternativa segura y asequible para trabajadores nocturnos, estudiantes y familias que requieren movilizarse en horarios no convencionales.
Con el Búho 3, las autoridades buscan reforzar la red de transporte metropolitano en horarios de baja frecuencia, garantizando a los ciudadanos la posibilidad de conectar barrios y municipios durante la noche y madrugada, reduciendo los riesgos de inseguridad y ampliando las opciones de movilidad urbana.